合成生物学系列第一弹质粒提取实验前言合成生物学是目前研究的热点之一也是众多养菌人重点的shui论文方向bushi身为一个养菌人终于大学毕业了为了更好的激励我自己系统性的梳理一遍我的知识网我会给大家从上游到下游从实验设计实验操作生信分析等多角度进行树立从宏观到微观展示给大家下面是我目前整理的流程图后期可能还会更新变动。先划重点质粒提取的核心是把细菌里的环状质粒DNA和基因组DNA、蛋白、RNA等杂质分离开拿到纯净的质粒为后续分子克隆、基因编辑、测序等实验铺路简单说提得好实验成功一半提崩了半天功夫全白费耗时30-40min主要实验器材单通道移液枪金属浴高速离心机主要试剂omega质粒小提试剂盒实验流程菌液在摇床中生长至对数期将培养的菌液8000×g离心3min4℃冰箱中保存的Solution I拿出用移液枪吸取250μL加入离心管中并吹吸混匀以重悬菌体并将重悬后液体转移至1.5mL EP管中加入250μL Solution II多次颠倒混匀静置3min加入300μL Solution III立减颠倒至白色絮状物出现13000×g离心10min取上清700μL转移至吸附柱中13000×g离心1min弃液在吸附柱中加入500μL HBC Buffer13000×g离心1min弃液加入700μL DNA Wash Buffer13000×g离心1min并重复60℃金属浴中开盖静置6min以提高提取率并提前将ddH2O放置在金属浴上吸附柱放置1.5mL EP管上在吸附柱中心白色处加入50μL ddH2O静置1min后13000×g离心1minNanoDrop取2μL液体测提取浓度保证后续试验NanoDrop结果解读检测指标理想范围结果解读异常原因 处理方案质粒浓度≥50ng/μL浓度合格能满足后续酶切、克隆、测序等实验需求浓度偏低/μL① 菌液量太少 / 摇菌不足→下次加 2mL 菌液 洗脱不充分→按 “点涂法” 加 ddH2O可重复洗脱 1 次③ 吸附柱失效→换全新试剂盒A260/A2801.8-2.0纯度合格几乎无蛋白污染低于 1.8蛋白污染① 吸上清时吸到沉淀→下次少吸 50-100μL② HBC Buffer 洗涤不充分→增加 1 次 HBC Buffer 洗涤 高于 2.0RNA 污染① 试剂盒无 RNase→加少量 RNase A终浓度 10μg/mL37℃孵育 15min重新纯化A260/A2701.5-1.8无酚类杂质污染低于 1.5酚污染① 洗涤步骤省略→严格按流程洗 2 次 DNA Wash Buffer 忘加乙醇→补加乙醇后重新洗涤实验小tips第1步摇菌时间根据菌株来定比较常用的大肠杆菌是8h。第4步有在不同情况下有一些不同的操作技巧。第一种情况是样本不多的情况这里的颠倒可以改成在EP管架上不同孔间摩擦管底以混匀。如果是样品较多可以用两个EP管架夹住管顶管底颠倒混匀。其实第4步主要目的是把白色的蛋白杂质沉下来根据我的经验其实10min一般这个蛋白沉淀的也不会特别好用枪头吸的时候离的近了该吸还是会吸上来我大概缩短了时间试了几遍其实大概5min到7min就差不多了当然如果你是要送去测序最好还是按标准做主要怕送测序公司时间比较长怕蛋白污染太严重。如果只是要做点突的话就还好你甚至可以少吸一点反正后面还要PCR。第9步这里最重要的点其实是加的水一定要滴在吸附柱的那层树脂上枪头一定要挨上因为这一步是为了把吸附柱的质粒溶在水里离下来通常加的体积又比较小不容易加进去所以一定要注意。另外如果贴上之后水因为太紧打不出去的话教大家一个小技巧就是可以用枪头打一点在柱子上然后抬起来一下然后再贴上去一点一点把水打到柱子上那个白色的部分会把水吸住。最开始课上做这个实验的时候班里几乎所有人都败下其实就是因为这一步没做好导致提出来的浓度很低。如果你提取的质粒后面会用去做同源重组比如Gibson质粒的浓度通常在50-120ng/μL即可与目的基因的浓度差距越大无论是浓度过低还是浓度过高需要做出体积变化越大不利于加样过程。如果用PCR仪做定点突变浓度要求会更低一些只需调整质粒及模板体积即可。合成生物学系列还在持续更新感兴趣的同学可以访问我的主页